ขั้นตอนการทำงานการศึกษาและจำแนกสายพันธุ์พืชโดยการวิเคราะห์ไอโซไซม์ แบ่งเป็นขั้นตอนใหญ่ ๆ ดังนี้
๑. การเก็บตัวอย่างพืชเพื่อการวิเคราะห์ไอโซไซม์
เนื่องจากพืชแต่ละชนิด ส่วนต่าง ๆ ที่จะแสดงผลของเอ็นไซม์จะแตกต่างกันไปตามชิ้นส่วนและอวัยวะของพืช แต่เรามักจะใช้ส่วนของพืชที่มีเนื้อเยื่อเจริญอยู่ และมีชีวิต ซึ่งจะแสดงผลการทำงานของเอ็นไซม์ให้เห็นได้ชัดเจนมากขึ้นกว่าเนื้อเยื่อที่ตายแล้ว อายุของพืชที่ต้องการเปรียบเทียบ ควรมีอายุเท่ากัน และถ้าเป็นพืชที่ยังไม่เคยมีรายงานการวิเคราะห์ไอโซไซม์มาก่อน การเก็บตัวอย่างควรเก็บทำชิ้นส่วนเท่าที่เป็นไปได้ ดังรายละเอียดที่จะกล่าวถึงต่อไป
ชิ้นส่วนของพืชที่ใช้เพื่อการวิเคราะห์ไอโซไซม์แบ่งออกเป็น ๔ ประเภท ได้แก่
๑. เมล็ด เช่น ข้าว ถั่ว สน ฯล
๒. ใบอ่อน เช่น ขนุน หวาย มะตูม ฯล
๓. ใบแก่ เช่น มะม่วง อ้อย ฯล
๔. ต้นกล้า เช่น ข้าว ถั่ว ฯล
๑. เมล็ด ไม่มีข้อยุ่งยากในการเก็บตัวอย่าง เพราะอาจจะนำเมล็ดมาเพาะให้เป็นต้นกล้าอีกครั้งก่อนที่จะนำมาสกัด หรือใช้เมล็ดโดยตรง ปริมาณตัวอย่างตั้งแต่ ๕๐-๑๐๐ เมล็ดต่อหนึ่งตัวอย่างพืชเมล็ดควรเป็นเมล็ดที่สมบูรณ์ ปราศจากเชื้อราหรือสิ่งสกปรกที่สามารถมองเห็นได้
๒. ใบอ่อน ในกรณีที่เป็นไม้ยืนต้นให้ตัดกิ่งที่มีส่วนของใบอ่อนอยู่ ปริมาณพอสมควรขึ้นอยู่กับขนาดของใบ ถ้าใบใหญ่ก็ไม่ต้องใช้มาก ถ้าเป็นใบเล็กหรือเป็นไม้ล้มลุก ให้เก็บมาไม่ต่ำกว่า ๕ กรัมต่อหนึ่งตัวอย่างพืช เลือกใบที่สมบูรณ์ ไม่ควรฉีกขาดหรือมีแมลงและโรคกัดกิน แล้วเก็บในที่เย็นอาจเก็บในกระติกน้ำแข็งหรือกล่องโฟม โดยใส่น้ำแข็งหรือน้ำแข็งแห้ง ถ้าเป็นน้ำแข็งธรรมดา ต้องคอยเติมอยู่เสมอ ก่อนที่จะนำมายังห้องปฏิบัติการ เพื่อรักษาสภาพเอ็นไซม์ให้คงอยู่มากที่สุด
๓. ใบแก่ เก็บลักษณะเดียวกับใบอ่อน
๔. ต้นกล้า ควรเป็นลักษณะที่เก็บตัวอย่างแล้วรีบนำมาสกัดเอ็นไซม์โดยทันที มิฉะนั้นก็ควรเก็บในที่มีอุณหภูมิไม่มากกว่า -๒๐ องศาเซลเซียส โดยทั่วไปจะเก็บเป็นเมล็ดมาก่อนแล้วมาเพาะเป็นต้นกล้าก่อนที่จะนำมาสกัดอีกครั้ง (การใช้ต้นกล้าอาจจะใช้ทุกส่วนของต้นพืช คือรากอ่อน ต้นอ่อน และใบอ่อน
๒. สะกัดเอ็นไซม์ (enzyme extraction) จากตัวอย่างพืช
โดยใช้สารสะกัดเอ็นไซม์ (extraction buffer)
๒.๑ สำหรับชิ้นส่วนพืชที่มียางหรือสารสีน้ำตาลน้อย (extraction buffer for tissue low inpheno1ics or other interfering substances)
สารที่ใช้
๑. ๕๐% Phosphosphate or Tris-HC1 buffer, pH ๗.๕
๒. ๔% Sucrose (W/V)
๓. ๑๔ mM Mercaptoethano1 (๐.๑% v/v)
๒.๒ สำหรับชิ้นส่วนพืชที่มีสารต่าง ๆ ที่จะขัดขวางสารสะกัดเอ็นไซม์ไม่ให้เกิดปฏิกิริยาได้เต็มที่ (extraction buffer for tissue with moderate levels of interfering substances)
สารที่ใช้
๑. ๗๕ mM Phosphosphate or Tris-HC1 buffer, pH ๗.๕
๒. ๕% Sucrose (w/v)
๓. ๑๔ mM Mercaptoethano1 (๐.๑% v/v)
๔. ๕% PVP-๔๐ (w/v)
๕. ๕๐ mM Ascorbic acid, Na salt
๖. ๑๐ mM Diethy1dithiocarbarmate
๗. ๐.๑ % Bovine serum a1bumin (w/v)
๒.๓ สำหรับชิ้นส่วนพืชที่มีสารต่าง ๆ ปริมาณมากที่จะขัดขวางสารสะกัดเอ็นไซม์ไม่ให้เกิดปฏิกิริยาได้เต็มที่ (extraction buffer for tissue with high levels of interfering substances)
สารที่ใช้
๑. ๑๐๐ mM Phosphosphate or Tris-HC1 buffer, pH ๗.๕
๒. ๗ % Sucrose (w/v)
๓. ๑๔ mM Mercaptoethano1 (๐.๑ % v/v)
๔. ๑๐% PVP-๔๐ (w/v)
๕. ๒๕๐ mM Ascorbic acid, Na salt
๖. ๒๐ mM Diethy1dithiocarbarmate
๗. ๑.๐% Bovine serum a1bumin (w/v)
๘. ๒๐ mM Sodium metabisu1fite
๙. ๒๐๐ mM Sodium tetraborate
วิธีการสะกัด
นำตัวอย่างพืชที่ต้องการศึกษามาชั่งน้ำหนักในปริมาณเท่า ๆ กัน มาบดในโกร่งที่เก็บไว้ในตู้เย็นให้ละเอียดเป็นแป้ง หรือเท่าที่เป็นไปได้ โดยอาจใช้ไนโตรเจนเหลวช่วยสำหรับใบพืชที่เหนียว แล้วใส่สารสะกัดเอ็นไซม์ ขึ้นอยู่กับชนิดของพืชว่าเหมาะสมกับสารสะกัดแบบใด อัตราส่วนที่ใช้คือตัวอย่างพืช ๐.๑ กรัมต่อสารสะกัด ๑๐๐ ไมโครลิตร หรือขึ้นกับความหนืดของสารที่สะกัดออกมาได้บดให้เป็นเนื้อเดียวกันกับตัวอย่างพืช หลังจากนั้นเทส่วนผสมทั้งหมดลงในหลอดทดลองแล้วเอาเข้าเครื่องหมุนเหวี่ยงที่สามารถตั้งอุณหภูมิได้ถึง ๕ องศาเซลเซียส หมุนเวี่ยงที่ความเร็ว ๑๐,๐๐๐ รอบ เป็นเวลา ๑๕-๒๐ นาที สามารถแยกส่วนน้ำใสซึ่งเป็นเอ็นไซม์ที่สะกัดได้ออกมากับตัวอย่างพืชที่ตกตะกอนอยู่ก้นหลอด ให้เทเฉพาะส่วนน้ำใส แล้วน้ำใส่หลอดขนาดเล็กเก็บไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ -๒๐ องศาเซลเซียส
๓. แยกเอ็นไซม์โดยวิธีทางอิเลคโตรโฟรีซีส (Run Electrophoresis) โดยใช้ระบบ Polyacry1amide gel electrophoreis (PAGE)
๓.๑ ประกอบอุปกรณ์ต่าง ๆ เพื่อการ Run Electrophoresis ตามคู่มือปฏิบัติการ ซึ่งขึ้นอยู่กับเครื่องมือที่เราจะใช้ หลังจากนั้นเป็นการเตรียมสารละลายสำหรับเตรียมเจลซึ่งเป็นตัวกลางที่ใช้แยกเอ็นไซม์ ซึ่งในที่นี้เป็นการเตรียม PAGE
ส่วนผสมของ PAGE มีดังนี้
Preparation of separating gel (๙%)
เจลชั้นที่ ๑ ใช้แยกเอ็นไซม
๓๐% Acrylamide ๙.๐ ml
๑.๕ M Tris-HC1 (pH ๘.๘) ๗.๕ ml
๑๐% APS (Ammonium persulfate) ๑๕๐ ul
TEMED ๑๕.๐ ul
H2o ๑๔.๗ ml
Total ๓๐.๐ ml
Preparation of stacking gel (๔%)
เจลชั้นที่ ๒ ใช้ในการจัดให้สารละลายตัวอย่างพืชที่มีเอ็นไซม์อยู่เริ่มต้นการ Run Electrophoresis ที่จุดเริ่มต้นเท่ากัน
๑๐% Acrylamide + ๒.๕% Bis ๒๐ ml
๑ M Tris-HC1 (pH ๖.๘) ๑.๕ ml
๑๐% APS ๑๐๐ ul
TEMED ๑๒ ul
H2O ๘.๔๐ ml
Total ๑๒ ml
เมื่อเตรียมเจลทั้ง ๒ ชั้นเรียบร้อยแล้ว (การเตรียมโดยละเอียดจะอยู่ในคู่มือห้องปฏิบัติการชีวโมเลกุลพืช) ต้องมีการเตรียมสารละลายที่ใช้สำหรับ Run Electrophoresis คือ Running buffer
Running buffer
สารละลายที่ใช้ในการ Run Electrophoresis
Glygine ๑๔.๔ g
Trizma base ๑๔.๑ g
In H2O ๑,๐๐๐ ml
๓.๒ หลังเตรียมเครื่องมือและสารละลาย ตลอดจนการเตรียมเจลพร้อมแล้วสำหรับการ Run Electrophoresis จึงมีการใส่ตัวอย่างพืชลงในช่องที่เตรียมไว้หรือจากนั้นเป็นขั้นตอนการ Run Electrophoresis ซึ่งเวลาที่ใช้ขึ้นอยู่กับขนาดของเครื่องมือ กระแสไฟ และความต่างศักย์ไฟฟ้า
๔. การตรวจสอบเอ็นไซม์ที่เกิดขึ้น
๔.๑ โดยการย้อมสีเจลที่ Run Electrophoresis เรียบร้อยแล้ว โดยอาจจะต้องศึกษาหลายระบบของเอ็นไซม์ ดังในห้องปฏิบัติการชีวโมเลกุลได้ศึกษาไอโซไซม์ หลายระบบสี ได้แก่ Acid phosphatase, Leucine aminopeptidase, Glutamate-xaloacetatetransaminase, peroxidase, esterase, Phosphogluconate dehydrogenase, Shikimate dehydrogenase, Malate dehydrogenase ฯล
๔.๒ เมื่อเห็นแถบสีเกิดขึ้นชัดเจนให้บันทึกผล หาค่า Rf (รายละเอียดอยู่ในคู่มือปฏิบัติการ) ถ่ายรูปแล้วทำให้เจลแห้งเพื่อเก็บเป็นข้อมูล นอกจากนั้นอาจเก็บข้อมูลต่าง ๆ ในคอมพิวเตอร์ได้อีกด้วย ไม่ว่าจะโดยการ scan ภาพของแถบสี ตลอดจนการใช้โปรแกรมสำเร็จรูปในการอ่านแถบสีที่เกิดขึ้น ฯล
๕. สรุปความแตกต่างที่เกิดขึ้นในแต่ละสายต้น ในแต่ละระบบเอ็นไซม์ที่ได้ตรวจสอบไอโซไซม์ นำข้อมูลเก็บไว้เป็นข้อมูลมาตรฐาน เก็บไว้ในธนาคารข้อมูล เพื่อนำไปใช้ประโยชน์ในการปรับปรุงพันธุ์พืชในอนาคต